實驗方案分享：針對猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）的定性實時聚合酶鏈反應（Real-time PCR）檢測

欄目：技術分享發布時間：2024-07-01

DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix 實驗方案 1

針對猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）的定性實時聚合酶鏈反應（Real-time PCR）檢測：

1. 研究背景與目的

- 猴痘病毒（MPXV）是正痘病毒屬（Orthopoxvirus, OPXV）的一種，自天花根除以來，已成為由OPXV引起的最嚴重疾病。

- 2022年全球猴痘疫情的爆發促使需要增加臨床測試的診斷能力。

- 研究目的是驗證一種定性的OPXV實時PCR檢測方法，并描述其在臨床實驗室診斷MPXV的分析性能。

2. 材料與方法

2.1 分析性能實驗材料

- 使用含有合成MPXV DNA的通用轉運介質（UTM）或病毒轉運介質（VTM）進行實驗。

2.2 DNA提取

- 使用核酸提取儀器進行自動化核酸提取。

2.3 實時TaqMan PCR檢測

- 總反應體積：20 μL（包含5 μL的模板和15 μL的主混合液）。

- 主混合液成分：

- 5 μL DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix （GDSBio, V5005）。

- 7 μL dH2O。

- 1 μL 正向引物（10 nm）。

- 1 μL 反向引物（10 nm）。

- 1 μL 探針（5 nm），針對OPXV目標序列。

- 臨床樣本測試：當加入內控時，dH2O的體積減少至4 μL，以允許加入1 μL的正向和反向引物（各10 nm）和探針（5 nm），針對人類RNAseP基因。

- 實時PCR操作：使用Prism 7500序列檢測系統（Applied Biosystems），并按照以下循環條件進行：

- 1個循環：95.0°C持續2分鐘。

- 40個循環：95.0°C持續3秒，60.0°C持續31秒。

在這項實驗中，實時PCR是用來檢測和定量猴痘病毒DNA的。使用的TaqMan化學方法是一種常用的熒光定量PCR技術，它可以在PCR擴增過程中實時監測DNA的累積量。通過這種方式，可以準確測定病毒DNA的濃度，從而幫助診斷猴痘病毒感染。

以下是實驗中使用的引物和探針序列：

1. OPXV目標的引物和探針序列：

- 正向引物(F): `TCAACTGAAAAGGCCATCTATGA`

- 反向引物(R): `GAGTATAGAGCACTATTTCTAAATCCCA`

- 探針(P): `FAM-CCATGCAATATACGTACAAGATAGTAGCCAAC`

2. 人類RNAseP基因作為內控的引物和探針序列：

- 正向引物(F): `AGATTTGGACCTGCGAGCG`

- 反向引物(R): `GAGCGGCTGTCTCCACAAGT`

- 探針(P): `Cy5–TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG`

3. 首月測試中得到的陽性患者樣本也在內部使用基于研究的猴痘特異性PCR進行了檢測，使用的引物和探針序列（針對B6R基因）：

- 正向引物(F): `ATTGGTCATTATTTTTGTCACAGGAACA`

- 反向引物(R): `AATGGCGTTGACAATTATGGGTG`

- 探針(P): `FAM-AGAGATTAGAAATA`

2.4 檢測限（LOD）

- 通過將MPXV DNA稀釋至不同濃度并檢測，確定LOD。

2.5 可重復性

- 使用100個拷貝/mL的MPXV陽性樣本和陰性UTM/VTM評估可重復性。

2.6 特異性

- 測試已知陽性患者樣本，包括單純皰疹病毒1型、2型等，以確定特異性。

2.7 一致性

- 使用88個盲樣（包括陰性和不同濃度的陽性樣本）進行測試。

這個實驗方案詳細地描述了從樣本收集、核酸提取、實時PCR檢測到結果分析的全過程。

DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix

貨號：V5005，V5006

產品簡介

DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix是用于一步法多重熒光定量PCR的試劑。它以探針和特異性引物來定量檢測RNA或DNA靶標序列。優化的緩沖液組分可以協助在一個體系內完成多達4個RNA或DNA序列的多重定量PCR。該混合液以4倍濃度提供，能夠加入更多的模板進行反應，從而提高檢測的靈敏度。